Змістовий модуль № Патохімія органів і тканин



Сторінка3/12
Дата конвертації11.04.2016
Розмір1.91 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   12

B.Дегідрогеназа


C.АлАТ
D.АсАТ

E.Карбоксипептидаза
6. У клініку поступив хлопчик 10 років з симптомами патології травної системи. Лікар призначив дослідження вмісту уропепсину. Уропепсин у педіатричній практиці визначається з метою оцінки:

A. секреторної діяльності слизової оболонки шлунка

B. інтенсивності процесів травлення в шлунку

C. моторно-евакуаторної діяльності шлунка

D. патологічних процесів у шлунку

E. патологічних компонентів у шлунковому соку
7. пацієнт 55 років поступив у клініку зі скаргами на втрату апетиту, здуття живота, важкість в області шлунка, відрижку повітрям із неприємним запахом. Причиною скарг може бути порушення процесів травлення в шлунку. Дослідження якого ферменту не буде інформативним у дорослих:

A.Реніну


B.Пепсину А

C.Уропепсину

D.Гастриксину

E. Пепсину В


Ситуаційні задачі

  1. У пацієнта К. підозрюють хронічний панкреатит, оскільки у нього спостерігаються явища гіповітамінозів, цукрового діабету, панкреатичної диспепсії(відраза до жирної їжі, кашкоподібний, з неприємним запахом стілець). Які лабораторні дослідження необхідно провести для підтвердження попереднього діагнозу?

  2. Пацієнт М. скаржиться на болі в області шлунка, втрату апетиту, загальну слабість. У сечі пацієнта виявлено підвищення рівня уропепсиногену. Про що свідчить даний показник?

  3. У секреті підшлункової залози пацієнта Л. спостерігається відсутність панкреатичного інгібітора трипсину. Чим небезпечний даний стан?


Індивідуальна самостійна робота студентів

Теми для реферативних доповідей:

Вплив лікарських препаратів (сечогінних засобів та сульфаніламідів) на виникнення гострого панкреатиту у людини.


Література


  1. Біохімічні показники в нормі і при патології / За ред. Склярова. – К.: Медицина, 2007. – 318 с.

  2. Біохімія ензимів. Ензимодіагностика. Ензимопатологія. Ензимотерапія: Посібник / Скляров О., Сольскі Я., Великий М., Фартушок Н., Бондарчук Т., Дума Д. – Львів: Кварт. – 2008. – 335 с.

  3. Бишевський А.Ш., Терсенов О.А. Біохімія для лікаря. – К.: Укр. центр духовної культури, 2001. – 395 с.

  4. Вавилова Т.П. Биохимия тканей и жидкостей полости рта: учебное пособие.2 е изд., испр. и доп. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008 – 208 с.

  5. Губергриц н.б., Беляева н.в. Экзо- и эндокринная функции поджелудочной железы: один шаг от дуэта до дуэли / Сучасна гастроентерологія. - № 4 (30). – 2006. – С. 18 – 30.

  6. Коротько Г.Ф. Рециркуляция ферментов пищеварительных желез. / РЖГГК. – 2011. – Т.21. – № 4. – С.14 – 21.

  7. Клінічна біохімія / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Медицина, 2006. – 432 с.

  8. Патогенетическое, клиническое и диагностическое значение фосфолипазы А2 в патогенезе панкреатитов (обзор литературы) / Н.Б.Губергриц, Г.М.Лукашевич, Ю.А.Загоренко и др.// Клиническая лабораторная диагностика. -2000. - №.5. – С.3 – 9.

  9. Скляров О.Я., Косий Є.Р., Скляров Є.Я. «Основи гастроентерології».- Львів, Кварт, 2011. – 289 с.

  10. Современные подходы к молекулярной диагностике и типированию клинических изоляторов Helicobacter pylori / Говорун В.М., Момыналиев К.Т., Смирнова О.В. и др.// РЖГГК. – 2002. - № 3. – С.57 – 64.

  11. Хомерики С.Г., Хомерики Н.М. Новые аспекты патогенетического лечения панкреатитов // Российский медицинский журнал. – 2000. – Т.8, № 7. – С. 288 – 290.

  12. Циммерман Я.С. Состояние иммунной системы у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки и влияние на нее современной терапии и иммуномодулирующих средств / Я.С. Циммерман, Е.Н. Михалева // Клин. мед. – 2003. – №1. – С.40 – 44.



Тема №10. КлініКО – БІОХІМІЧНІ КРИТЕРІЇ захворювань гепатобіліарної системи

Мета заняття: Знати патохімічні процеси, що лежать в основі розвитку захворювань гепатобіліарної системи. Знати біохімічні основи корекції порушень метаболізму печінки та жовчовиділення фармпрепаратами. Знати основні шляхи детоксикації ксенобіотиків та фармпрепаратів в організмі людини. швидкістю виведення антипірин в слині людини.

Актуальність теми: Чисельна кількість патологічних процесів людського організму пов’язана з порушенням функціонального стану гепатобіліарної системи. Оцінка активності ферментативних систем організму, які здійснюють метаболізм ксенобіотиків, зокрема лікарських препаратів, представляє значний інтерес як для наукових досліджень, так і для практичної медицини. Оцінка детоксикаційної функції печінки відіграє важливу роль для моніторингу лікування і прогнозу захворювання. Найбільш простими і надійними методами оцінки детоксикаційної функції є непрямі, зокрема визначення часу півелімінації антипірину.

Студентам необхідно оволодіти методом кількісного визначення антипірину у біологічних рідинах з метою оцінки функціональної активності монооксигеназ мікросомного окислення.



Конкретні завдання:

  • Вміти кількісно визначити концентрацію антипірина у слині людини

  • Визначити період півелімінації антипірину.

  • Вміти оцінити активність монооксигеназ мікросомного окислення за періодом півелімінації антипірину з організму

Теоретичні питання

1. Біохімічні особливості змін при пошкодженні паренхими та мезенхими печінки.

2. Порушення ліпідного, білкового, пігментного обмінів при різних патологіях гепатобіліарної системи.

3. Біохімічні синдроми та функціональні проби при дослідженні процесів обміну в клітинах печінки в нормі та при патології.

4. Порушення біохімічних процесів в печінці при окремих захворюваннях, їх діагностична оцінка.

5. Зміни фізичних властивостей та біохімічного складу жовчі при хворобах печінки. Фармпрепарати, які стимулюють утворення і жовчовиділення.

6. Механізми вірусного, алкогольного та токсичного пошкодження гепатоцитів.

7. Біохімічні основи корекції порушень метаболізму у печінці фармпрепаратами.



Блок інформації

Індивідуальна різниця чутливості до різноманітних ліпофільних сполук пов’язана з індивідуальною варіабельністю активності ферментів І і ІІ фаз детоксикації. Наприклад, серед популяції людей виділяють швидких і повільних окислювачів, швидких і повільних ацетиляторів, що визначається генетично детермінованою ферментативною активністю.

Порушення детоксикаційної функції проявляються інгібуванням, активацією або дискоординацією активності ферментів перетворення (І фаза) і кон’югації (ІІ фаза) ендогенних (білірубін, крезол, скатол, гормони) та екзогенних (бензойна кислота, алкоголі, фармакологічні прерарати) сполук.

На метаболічні перетворення субстратів в системі мікросомального окислення впливає велика кількість різноманітних факторів: спосіб харчування, характеристика кишкової флори, умови зовнішнього середовища (температура, пора року, висота над рівнем моря), а також стать і вік. У людського ембріону та новонародженої дитини активність ферментів I та II фаз детоксикації, пов’язаних з мікросомальною фракцією, є низькою. З віком вона зростає. При вагітності і у похилому віці - знижується. Виявлене зниження активності монооксигеназних ферментів печінки в умовах гіпербаричної оксигенації і гіпоксії, під впливом іонізуючого випромінювання, при фізичних навантаженнях, впливі теплової фізіотерапії і зміні умов довкілля. Зростання тривалості світлового дня знижує активність ферментних систем мікросомального окиснення в печінці, в нічний час їх активність зростає. Знижуються біотрасформаційні процеси при голодуванні, дефіциті в їжі білків, гіповітамінозі В1, В2, Вс, А, С.

Виявлено зміни активності ферментів біотрансформації при дисфункції печінки, нирок, щитоподібної залози, порушеннях серцевої діяльності, новоутвореннях та багатьох інших патологічних станах. В залежності від фази і активності патологічного процесу активність ферментів може бути підвищеною або зниженою у порівнянні з нормальними величинами. Незалежно від нозології виявлено однотипне пригнічення ферментів мікросомального окиснення гепатоцитів при ендогенній інтоксикації, що супроводжує багато захворювань. Суттєво знижується кількість цитохрому Р-450 при гострому каловому перитоніті, гострій кишковій непрохідності, гострій нирковій недостатності, опіках, гнійних запальних захворюваннях, тиреотоксикозах та ін. Виявлено, що в тій чи іншій мірі інгібують дію ферментів мікросомального окиснення недоокиснені продукти обміну, кініни, катехоламіни, альдегіди, кетони, біогенні аміни, низькомолекулярні пептиди, сечовина, сечова кислота, креатинін. Безпосередньо пригнічують каталітичну активність цитохрому Р-450 ендотоксини Еscherichia соli, гістамін, сечовина. Серед речовин-індукторів, що стимулюють синтез цитохрому Р-450 та інших компонентів окислювальної системи, є гормони, лікарські засоби, інсектициди, канцерогени тощо. Всього біля 300 речовин. Індуктори інколи використовуються як лікарські засоби. Наприклад, жовтяницю новонароджених, ензимопатії - синдром Жильбера, синдром Кріглера-Наджара, зумовлені дефіцитом глюкуронілтрансферази, лікують зиксорином, низькими дозами фенобарбіталу, іншими індукторами ферментів мікросомального окислення та кон’югаційних процесів.

Печінка бере активну участь у метаболізмі різноманітних ксенобіотиків, у тому числі ліків. На теперішній час відомо більше 600 лікарських препаратів, які мають гепатотоксичну дію. Лікарські ураження печінки є причиною 2-5% всіх госпіталізацій з приводу жовтяниці і 10-20% всіх випадків розвитку фульмінантної (швидкопрогресуючої) форми печінкової недостатності.

Зміна активності ферментів мікросомального окиснення в організмі людини у різних патологічних станах являє собою серйозну проблему для клінічної медицини, оскільки більшість фармпрепаратів є субстратами І і ІІ фаз детоксикації гепатоцитів. Активація процесів біотрансформації спричиняє прискорений метаболізм таких препаратів і, відповідно, змінює єфективність їх дії, а інгібування процесів біотрасформації - посилює фармацевтичну дію лікарських препаратів за рахунок їх сповільненого метаболізму.

ПРАКТИЧНА РОБОТА

Дослід 1. Визначення вмісту антипірину в слині людини за методом Вrodie.

Принцип методу. Метод базується на спектрофотометричному вимірюванні 4-нітрозоантипірину, який утворюється при додаванні натрію азотистокислого (NaNO2) і сульфатної кислоти до безбілкових зразків, що містять антипірин.

Матеріальне забезпечення: слина; цинковий реактив (100 г ZnSO4·7H2O розчинити у дистильованій воді, додати 40 мл 6 н Н2SO4 і довести об’єм до 1 л дистильованою водою); натрію гідроксид (0,75н); 4 н Н2SO4; NaNO2 (0,2%); розчини антипірину для побудови калібрувальної кривої (від 3 до 20 мкг/л, готуються на 0,07 н Н2SO4); спектрофотометр (СФ), піпетки, колбочки, сухі пробірки.

Хід роботи. Антипірин вживається одноразово, натще у дозі 10 мг на 1 кг маси. Визначення вмісту препарата у слині проводять до вживання антипірину і протягом доби через рівні проміжки часу.

Одержані проби слини центрифугують протягом 10 хв. для осадження твердих часточок. У колби об’ємом 50 мл вносять по 2 мл надосадової рідини, 2 мл дистильованої води і по 2 мл цинкового реактива. Потім по краплях при постійному струшуванні приливають 2 мл 0,75 н NaОН у кожну. Вміст колбочок центрифугують у пластмасових центрифужних пробірках протягом 15 хв. По 3 мл чистого супернатанту переносять у пробірки і поміщають на 5 хвилин на водяну баню за температури 25єС. Через 5 хвилин додають по 0,05 4 н Н2SO4 і вимірюють оптичну густину розчинів за =350 нм на СФ. Потім додають по 0,1 мл 0,2% розчину NaNO2, інкубують 20 хвилин за температури 25єС і вимірюють оптичну густину за аналогічних умов. Концентрацію антипірина розраховують, використовуючи калібрувальний графік, побудований за оптичними густинами стандартних розчинів препарата, після їх інкубації з сульфатною кислотою і азотистокислим натрієм.

Для підрахунку часу півелімінації антипірина будують криву залежності логарифма концентрації антипірина від часу, який минув з момента вживання медикамента. Отримана пряма лінія перетинається з віссю ординат, визначаючи початкову концентрацію. Час, необхідний для зменшення величини С0 наполовину, тобто час піввиведення, визначають за діаграмою.

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.


Дослід 2. Визначення вмісту білірубіну в сироватці крові.

Принцип методу. Білірубін взаємодіє з діазореактивом з утворенням азобілірубіну рожевого кольору. Інтенсивність забарвлення розчину пропорційна концентрації білірубіну і може бути визначена фотометрично при зеленому світлофільтрі (довжина хвилі 530-560 нм). Кон’югований білірубін дає швидку (пряму) реакцію. Реакція некон’югованого білірубіну значно повільніша. Додаванням акселераторів (кофеїн та ін.) вільний білірубін можна перевести в розчинний стан і визначити кількість загального білірубіну. При використанні буферного розчину без акселераторів визначається кон’югований білірубін, а при використанні буферного розчину з акселераторами – загальний білірубін. Кількість некон’югованого білірубіну дорівнює різниці між кількістю загального і прямого білірубіну.


Визначення вмісту білірубіну рекомендують виконувати відразу ж після отримання проб, щоб попередити його окиснення на світлі; вплив прямого сонячного світла може бути причиною 50% зниження вмісту білірубіну вже через одну годину. Проби повинні бути проаналізовані протягом 2 год з момента забору крові, якщо вони зберігаються при кімнатній температурі, і в темряві, або протягом 12 год при умові зберігання при температурі 2-8 С в темряві. Гемоліз еритроцитів прямо пропорційно знижує показники кількості білірубіну, який визначається у сироватці крові; виражена ліпемія обумовлює підвищені показники білірубіну.

Матеріальне забезпечення: сироватка крові; реагент 1 без акселератора; реагент 1 з акселератором; реагент 2; пробірки; дистильована вода; піпетки; ФЕК.

Хід роботи. Визначення проводять за схемою:

Реактиви

Дослід
Контроль

Дослід

Контроль




Зв’язаний білірубін

Зв’язаний білірубін

Загальний білірубін

Загальний білірубін

реагент 1 без акселератора

3 мл

3 мл

-

-

реагент 1 з акселератором

-

-

3 мл

3 мл

реагент 2

0,075 мл

0,075 мл

0,075 мл

0,075 мл

сироватка крові

0,4 мл

-

0,4 мл

-

вода дистильована

-

0,4 мл

-

0,4 мл

Суміші швидко перемішують і точно через 5 хв визначають оптичну густину при зеленому світлофільтрі (560 нм) проти контрольних проб з дистильованою водою. Кількість білірубіну визначають за калібрувальною кривою.

Пояснити отримані результати. Зробити висновок.

ЗНАЧЕННЯ ДЛЯ КЛІНІКИ ТА ФАРМАЦІЇ

У нормі вміст загального білірубіну становить 1,7-20,5 мкмоль/л (0,1-1,2 мг/100 мл), некон’югованого – 1,7-17,1 мкмоль/л (0,1-1,0 мг/100 мл), кон’югованого 0,86-4,30 мкмоль/л(0,05-0,25 мг/100 мл). Токсична дія високих концентрацій білірубіну крові проявляється ураженням центральної нервової системи, виникненням некротичних ділянок в паренхіматозних органах, пригніченням клітинного імунітету, розвитком анемії внаслідок гемолізу еритроцитів. Важливу роль в токсичній дії білірубіну відіграє його фотосенсибілізуюча дія. Білірубін, як метаболіт протопорфірину, одного з найбільш активних фотосенсибілізаторів, здатний, використовуючи квантову енергію світла, переводити хімічно інертний молекулярний кисень у надзвичайно активну, синглетну форму. Синглетний кисень руйнує будь-які біологічні структури, окиснює ліпіди мембран, нуклеїнові кислоти, амінокислоти білків. У наслідок активації ним перекисного окиснення ліпідів і відщеплення глікопротеїнів, а також високомолекулярних пептидів мембран виникає гемоліз еритроцитів. Нагромадження в крові білірубіну вище 27,4-34,2 мкмоль/л призводить до відкладання його в тканинах і появи жовтяниці. В залежності від причини жовтяниця може бути надпечінкова (гемолітична), печінкова (паренхіматозна), підпечінкова (обтураційна).

При гемолітичній жовтяниці печінка не встигає зв’язувати велику кількість вільного білірубіну, що утворюється внаслідок підсиленого гемолізу еритроцитів. У результаті в плазмі крові спостерігається підвищений вміст білірубіну (до 90-100 мкмоль/л) за рахунок вільного білірубіну. Така форма жовтяниці спостерігається при гемолітичній, перніціозній анемії.

При паренхіматозній жовтяниці внаслідок пошкодження гепатоцитів знижується кон’югаційна здатність печінки, знижується синтез жовчі, кон’югований білірубін частково попадає назад у кров. Білірубінемія різного ступеня, яка при цьому спостерігається, розвивається за рахунок фракції як зв’язаного, так і вільного білірубіну. Паренхіматозна жовтяниця виникає при жирових гепатозах (стеатозах), гепатитах (вірусних, токсичних), цирозах печінки.

При обтураційній жовтяниці внаслідок закупорки (камінцями, пухлиною) жовчних протоків жовч переповнює їх і попадає в русло крові. Білірубінемія, яка при цьому розвивається, характеризується значною вираженістю (до 170-700 мкмоль/л) в основному за рахунок фракції зв’язаного білірубіну.

У новонароджених внаслідок стерильності кишки білірубін не перетворюється у похідні (метаболіти), але активно всмоктується у кров, зумовлюючи гіпербілірубінемію. Крім того, у новонароджених часто спостерігається тимчасова понижена активність білірубінглюкуронілтрансферази, що є причиною жовтяниці новонароджених, яка характеризується високим вмістом у крові некон’югованого білірубіну.

Захворювання, що викликають зростання некон’югованого білірубіну: гемолітична анемія, перніціозна анемія, жовтяниця новонароджених, хвороба Жільбера, синдром Криглера-Найяра, синдром Ротора.
Контроль виконання лабораторної роботи

1. За допомогою яких методів можна оцінювати активність ферментів І фази детоксикації?

2. За допомогою яких методів можна оцінювати активність ферментів ІІ фази детоксикації?

3. Який принцип визначення антипірину у біологічних рідинах за методом Вrodie?

4. Як визначити період півелімінації антипірину з організму?

5. Яким методом можна визначити загальний і зв’язаний білірубін крові ?

6. Яка концентрація білірубіну в крові здорової людини?

7. У хворого на гепатит показник де Рітіса (відношення активності АсАТ до активності АлАТ) становить 0,50. Про що це свідчить? Як внутрішньоклітинна локалізація цих ензимів впливає на зростання їх активності у крові при цитолітичних процесах різного ступеня?

8. У хворого вміст альбумінів у крові становить 15 г/л при нормі 32-55 г/л, протромбіновий час – 40 с при нормі 12-20 с. Про які біохімічні порушення це свідчить і до яких наслідків може призвести?

Приклади тестів

1.

Тести

Варіанти відповідей

Для діагностики захворювань печінки використовують ряд біохімічних тестів (проб). На який із наступних патологічних станів найвірогідніше вказують такі зміни у плазмі крові:

1. Зростання кількості АлАТ

2. Зростання кількості АсАТ

3. Збільшення активності лужної фосфатази

4. Зниження концентрації альбуміну

5. Збільшення часу згортання крові

6. Зростання концентрації прямого білірубіну

7. Зростання концентрації холестерину

8. Зростання концентрації жовчних кислот

9. Зростання концентрації б-фетопротеїну



А. Цитоліз гепатоцитів, зростання проникнення мембрани гепатоцитів при цирозі, гепатиті, гепатозі, пухлинах

B. Порушення жовчовиділення (холестаз)

C.Зменшення маси функціонально активної тканини печінки

D. Рак печінки





2.

Тести

Варіанти відповідей

Знешкодження токсичних речовин та інактивація біологічно активних речовин у гепатоцитах здійснюється різними реакціями. Якою із наступних реакцій перетворюються:

1. Ароматичні кислоти (бензойна)

2. Ароматичні вуглеводні

3. Барбітурати

4. Білірубін

5. Етанол

6. Естрогени

7. Скатол і індол

8. Кадаверин і путресцин

9. Катехоламіни

10. Нітробензол

11. Серотонін і гістамін

12. Сульфаніламіди

13. Фенол



А. Окислення

B. Відновлення

C. Дезамінування

D. Ацетилювання

E. Метилювання

F. Кон’югація з глюкуроновою кислотою

G. Кон’югація з сульфатною кислотою

H. Кон’югація з гліцином



3. У пацієнта діагностовано гострий вірусний гепатит. Спостерігається пожовтіння склер очей, хворий скаржиться на біль у правому підреберї. Які порушення білкового обміну будуть спостерігатися при цьому?

А. Гіпоальбумінемія

B. Геморагії

C. Гіпераміноацидемії

D. Азотемії

E. Гіпер-б-глобулінемії



4.У пацієнта спостерігається понижене утворення ліпопротеїнів дуже низької щільності (ЛПДНЩ) і, як наслідок, жирове переродження печінки. Причиною цього можуть бути наступні причини:

А. Білкове голодування

B. Нестача в їжі холіну і метіоніну

C. Отруєння гепатотропними токсичними речовинами

D. Алкоголізм

E. Загальне ожиріння


5. У жінки віком 46 років із жовчнокам’яною хворобою, розвинулась жовтяниця. При цьому сеча стала темно-жовтого кольору, кал – знебарвлений, у плазмі крові виявлено підвищений вміст кон’югованого (прямого) білірубіну. Який вид жовтяниці можна запідозрити?

  1. Обтураційну

  2. Гемолітичну

  3. Паренхіматозну

  4. Жовтяницю новонароджених

  5. Хворобу Жільбера

6. У малюка, що народився недоношеним, спостерігається жовте забарвлення шкіри та слизових оболонок. Причиною цього стану є тимчасова нестача ензиму



  1. УДФглюкуронілтрансферази

  2. Порфобілінгенсинтази

  3. д-Амінолевулінатсинтази

  4. Гемоксигенази

  5. Білівердинредуктази

7. У хворого із жовтяницею виявлено: підвищення у плазмі крові вмісту загального білірубіну за рахунок непрямого (вільного), у калі і сечі – вмісту стеркобіліну, вміст прямого (зв’язаного) білірубіну в плазмі крові – в межах норми. Який вид жовтяниці можна запідозрити?



  1. Гемолітичну

  2. Жовтяницю новонароджених

  3. Паренхіматозну

  4. Механічну

  5. Хворобу Жільбера

8. Вкажіть, яка сполука утворюється внаслідок біотрансформації кодеїну в організмі?

А. Морфін

B. Фенобарбітал

C. Гексобарбітал

D. Амінозин

E. Сульфодиоксид
9. Вкажіть сполуки, що беруть участь у знешкоджувальних реакціях печінки


  1. УДФ-глюкуронова кислота

  2. Гістамін

  3. Індикан

  4. ФАФС

  5. Орнітин

10. Знешкодження токсичних речовин та інактивація біологічно активних речовин у гепатоцитах забезпечується різними реакціями. У ході якої з наступних реакцій перетворюються катехоламіни?



  1. Окиснення

  2. Відновлення

  3. Дезамінування

  4. Ацетилування

  5. Метилування


Ситуаційні задачі

  1. У хворого на гострий гепатит показник де Рітіса (відношення активності АсАТ до активності АлАТ) становить 0,50. Про що це свідчить? Як внутрішньоклітинна локалізація цих ферментів обумовлює їх зростання у крові при цитолітичних процесах різного ступеня?

  2. У новонароджених і у дітей до 8-тижневого віку недорозвинена ферментна система мікросомального окислення печінки. Поясніть, чому відносні дози лікарських препаратів для таких дітей повинні бути значно меншими порявняно з дозами для дітей старшого віку і дорослих?

  3. Реакція на індикан у сечі пацієнта позитивна, становить 50 мкмоль/добу при нормі 46,9-56,4 мкмоль/добу. Представити механізм утворення індикану. Яку функцію печінки можна оцінити за його допомогою?

  4. Субстрати мікросомальних гідроксилаз індукують синтез молекул цитохрому Р-450 в печінці. Висока індукуюча здатність властива фенобарбіталу (снодійному препарату). Як можна пояснити механізм звикання до снодійних засобів (барбітуратів) і до інших лікарських речовин, які окиснюються монооксигеназною системою ендоплазматичного ретикулуму гепатоцитів ?

  5. Розвиток цитолітичного синдрому при захворюваннях печінки викликає збільшення в крові органоспецифічних ферментів. Назвіть всі органоспецифічні ферменти гепатоцитів. Обгрунтуйте клініко-діагностичне значення їх визначення


Індивідуальна самостійна робота студентів
Тема для реферативних доповідей

1. Фармпрепарати – індуктори І і ІІ фаз детоксикації у печінці.

2. Спадкові порушення розпаду гему та біохімічні основи їх корекції фармпрепаратами.



Література

  1. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – К: Медицина, 2010. – 360 с.

  2. Біохімічні показники в нормі і при патології. Довідник / За ред.. Склярова О.Я – К.: «Медицина» , 2007. – 318с.

  3. Камышников В.С. Клинические лабораторне тесты от А до Я и их диагностические профили. Справочное пособие.- М. : МЕДпресс-информ, 2007.- 313 с.

  4. Клінічна біохімія / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Медицина, 2006. С . – 432 с.

  5. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. - М.: Мир, 2000. - С. 298-313.

  6. Цыганенко А.Я., Жуков В.И., Мясоедов В.В., Завгородний И.В. Клиническая биохимия. – М.:Триада-Х, 2002. – С. 49-70 .

  7. The Liver: Biology and Pathobiology, ed. by I.Arias, H.Popper,D.Schachter, D.A.Schafritz. New-York: Raven Press, 1998.- 900 p.

  8. Zimmerman H.J., Maddrey W.C. Toxic and drug-induced hepatitis. In: Schiff L., Schiff E.R. (eds). Diseases of the Liver, 7th ed. Philadelphia, J.B. Lippicott, 1999.- 707-783.

  9. Joshiba Е.М., Steinbrecher U.P. Interpreting Liver Function Tests; A Practical Guide for Clinical Use // Consultant.- March 1997.- Р. 569-577.

Тема №11. Порушення біохімічних процесів в серцево-судинній системі та їх діагностика

Мета: Вивчити патохімічні процеси при серцево-судинних захворюваннях (стенокардії, гіпертензії, атеросклерозу, інфаркту міокарда) та дати їх оцінку на основі визначення у сироватці крові активності аспартатамінотрансферази, лактатдегідрогенази.

Актуальність теми. У зв’язку з широким розповсюдженням серцево-судинних захворювань, важким перебігом і наслідками, біохімічні основи корекції цих змін при патології, використання біохімічних методів визначення активності амінотрансфераз та лактатдегідрогенази мають важливе значення в клінічній практиці.

Конкретні завдання:

  • Вміти у хворого інфарктом міокарда визначити в динаміці активність аспартатамінотрансферази і лактатдегідрогенази.

  • Дати оцінку отриманим результатам, зробити висновки.


Теоретичні питання

  1. Особливості обміну речовин у м’язовій тканині серця.

  2. Патохімічні зміни у серцевому м’язі при інфаркті міокарда та їх оцінка.

  3. Лабораторна діагностика інфаркту міокарда

  4. Зміни біохімічних процесів при гіпертензіях.

  5. Атеросклероз, біохімічні показники обміну речовин.

  6. Біохімічні основи корекції фармпрепаратами порушень при патології серцево-судинної системи.


Блок інформації

Особливості обміну речовин у серцевому мязі.

Головним енергетичним матеріалом для серцевого м’язу є вуглеводи та вільні жирні кислоти. Використання цих субстратів залежить від рівня їх у переферичній крові, що обумовлене співвідношенням вуглеводів і ліпідів у харчовому раціоні.

Великі енергетичні затрати вимагають постійного забезпечення необхідною кількістю хімічної енергії у вигляді АТФ. Серце поглинає з крові коронарних артерій близько 70% кисню. Синтез великої кількості АТФ забезпечується добре розвиненою структурою мітохондрій. У лівому шлуночку мітохондрії займають близько 30-35% від об’єму кардіоміоцитів.

Окислення глюкози через реакції аеробного гліколізу, лактату через піруват, а також ВЖК ведуть до утворення ацетил-КоА. У виняткових випадках (тривале голодування, важка форма діабету) кетонові тіла (ацетоацетат) через ацетил-КоА використовуються також.

Ацетил –КоА поступає в цикл Кребса, де окислюється до кінцевих продуктів (СО2 і Н2О) а утворені відновлені форми нікотинамідних і флавінових ферментів через систему дихальних ферментів у окисному фосфорилюванні утворює АТФ.Утворена АТФ використовується: 60-70% йде на скорочення серцевого м’яза ,10-15% на роботу йонних помп, 5-7% на анаболічні процеси втому числі синтез білків, нуклеїнових кислот та структурних ліпідів , тобто цілісності клітинних структур.

Це гарантує тривале динамічне відновлення і робить можливою адаптацію серця до змінних умов роботи. Ефективнівсть механічної роботи серця у цілому можна розглядати як відношення енергії яку необхідно затратити для нагнітання певного обєму крові проти опору, що виникає у аорті , до енергії , яка звільняється при використанні кисню.У стані спокою це відношення складає 12%,а при фізичному навантаженні 18-25%.

Кардіоміоцити передсердь різних ссавців мають добре розвинену ендоплазматичну сітку і комплекс Гольджі, які беруть участь у синтезі передсердних гранул, які подібні на секреторні гранули ендокринних клітин. В цих структурах утворюється натрій-уретичний фактор (ПНФ. АНФ, НУФ), який має пептидну природу і є модулятором або антагоністом системи ренін-ангіотензин-альдостерон.

Патохімія ішемії міокарда.

Найчастіше причиною ішемії серцевого м’яза є атеросклероз коронарних судин.Сформована атеросклеротична бляшка обумовлює критичне звуження коронарних артерій і створює передумови для повного закриття просвіту судини , особливо при спазмі .

Спазми можуть мати наступний механізм:


  1. підвищена реактивність пошкодженої ділянки коронарної артерії на судиннозвужуючий фактор призводить до підвищеного виділення серотоніну внаслідок стимуляції серотонінергічних рецепторів гладкої мускулатури епікардіальних коронарних артерій, посиленої відповіді на інші медіатори – норадреналін,ангіотензин II ;

  2. пошкодження атеросклерозом ендотелія веде до місцевого зменшення виділення гуморальних речовин з судиннорозширюючими і антиагрегатними властивостями – простацикліна і так званого фактора розслаблення ;

  3. зміна фізіологічних властивостей мембрани клітин – рецепторного апарату і систем іонного транспорту, можливо, Са2+,в середовищі з високим вмістом холестерину, звільнення із тромбоцитарних агрегантів потужного вазоконстріктора і проагреганта тромбоксана А2, а також серотоніна.

Ішемічна хвороба серця з її основними клінічними проявами викликана порушенням рівноваги між потребою в кисні та його постачанням до міокарда.Порівняно невелика кількість кисню, який залишається в еритроцитах капілярів чи зв’язаний з гемоглобіном, швидко використовується. Ішемія впливає на метаболізм, функції та структуру клітин міокарда і веде до їх смерті.

Головна особливість ішемії полягає у тому, що потреба у високоенергетичних фосфатних сполуках (наприклад,АТФ)є значно вищою,ніж можливість продукції цих сполук.Гальмування окислювальних процесів,крім значного зниження рівня клітинної АТФ,також веде до нагромадження деяких потенційно шкідливих метаболітів(Н+,Са2+,вільні жирні кислоти, лактат, ацетил-коензим-А, ацетилкарнітин, вільні радикали і т.д.), які порушують клітинний гомеостаз і руйнують внутрішньоклітинні структури.Наслідки метаболічних та електролітних порушень виявляються у вигляді нейро-та електрофізіологічних змін та порушенням скоротливості серця.

Дуже раннім проявом ішемії міокарда є втрата клітинами К+. що веде до появи анаеробного гліколізу та до порушення скоротливості серця ще перед істотним зниженням рівня АТФ в тканинах.Гіпокаліємія, внутрішньоклітинний ацидоз, місцеве вивільнення катехоламінів (з утворенням циклічного АМФ), нагромадження лізофосфоліпідів,а перевантаження клітин кальцієм веде до електрофізіологічних змін на субклітинному рівні.Надмірний вміст кальцію може мати цілий ряд негативних наслідків для міоцита, викликаючи , зокрема , активацію протеаз, ліпаз, фосфоліпаз, АТФаз, пригнічення окислювального фосфорилювання у мітохондріях, кальцифікацію мітохондрій (особливо під час реперфузії міокарда).

Протягом перших 15 хв. гострої ішемії, коли порушення в міоцитах ще є зворотніми, має місце ряд ультраструктурних змін: набряк мітохондрій і втрата ними крист, набряк цілої клітини, агрегація ядерного хроматину вздовж ядерної мембрани, зменшення запасів глікогену та ін.

Необхідно відзначити ще дві риси які відрізняють змінені міоцити від незворотньопошкоджених, а саме: безсистемна зернистість, яка з’являється в середині мітохондріального матриксу, та розриви сарколеми .До складу цих депозитів входять: фосфат Са, ліпіди та білки, які правдоподібно виникають з мембранних структур і звільняються внаслідок детергентної дії жирних кислот, ацетил-коензиму-А і ацетил-карнітину.

Лабораторна діагностика інфаркту міокарда.

Традиційно діагностика інфаркту міокарда опирається щонайменше на два з 3-х діагностичних критеріїв:

1. гострий біль у грудній клітці;

2. зміни в електрокардіограмі, що вказують на присутність ішемії;

3. лабораторні дані.

У лабораторній діагностиці інфаркту міокарда особливого значення набуває динаміка зростання у сироватці крові вмісту білків , в першу чергу ензимів, які походять з пошкоджених клітин міокарда .Некроз клітин серцевого м’яза виявляється вже через 20 хв. після гострого тромбозу коронарної артерії. Швидкість наростання некрозу може суттєво різнитися і залежить від таких факторів як периферичний кровообіг і потреба міокарда в кисні .Внаслідок некрозу клітин відбувається вивільнення їх вмісту у міжклітинну рідину :



  • спочатку клітина втрачає внутрішньоклітинні йони (К+, Zn2+, Mg2+, неорганічний фосфат) внаслідок порушення енергетичнозалежної роботи йонних помп;

  • далі з’являються внутрішньоклітинні метаболіти (лактат, аденозин) внаслідок порушення регуляції внутрішньоклітинного метаболізму ;

  • накінець, відбувається втрата внутрішньоклітинних макромолекул (міоглобін, тропонін-Т, ензими та інші білки) внаслідок ініційованого процесу функціональної та структурної дезінтеграції клітинних мембран.

Лабораторні обстеження, які роблять можливим раннє виявлення порушень у ліпідному обміні , є вирішальним для правильної профілактики і лікування ішемічної хвороби серця. Вони стосуються, головним чином, визначення рівня холестерину і тригліцеридів у сироватці крові, а також визначення LDL-холестерину (фактор ризику) і HDL-холестерину (фактор захисту).

Зараз все більше лабораторій пропонує великий набір тестів з визначення ліпопротеїну А-1 (Аро-А-1), основного аполіпопротеїну HLH (65% всіх аполіпопротеїнів HDL) та аполіпопротеїну В (Аро-В), який є основним ліпопротенїном LDL.У пацієнтів з інфарктом міокарда спостерігається низький рівень Аро-А та високий рівень Аро-В.

Звичайно у діагностиці інфаркту міокарда використовують визначення у сироватці крові активності 3-х ензимів : креатинкінази (КК), лактатдегідрогенази (ЛДГ) та аспартатамінотрансферази (АсТ).

Обидві амінотрансферази – АсТ (цитоплазматична і мітохондріальна) та АлТ (цитоплазматична )- у нормальному стані присутні в плазмі крові людини, спинномозковій рідині та в слині, але не виявляються в сечі.Звичайно для дослідження беруть сироватку крові .Неслід допускати її гемолізу, оскільки активність АсТ і АлТ в еритроцитах є вищою, ніж у нормальній сироватці.

При інфаркті міокарда активність АсТ у сироватці зростає, починаючи з 8-12 години; максимальна активність дасягається через 24-36 год., а її повернення до нормального рівня відбувається на 4-6 день (мал.2).

У близько 99% пацієнтів з інфарктом міокарда активність АсТ у сироватці є у 2-10 разів вищою від верхньої межі нормального значення .При інфаркті міокарду виявляється також зростання активності АлТ у сироватці, але в значно меншій мірі, ніж зростання активності АсТ. При інфаркті міокарда співвідношення активностей АсТ/АлТ у дільшості випадків перевищує 2, а спввідношення . менше від 1, переважно вказує на ураження печінки.

При інфаркті міокарда рівень ЛДГ починає зростати в плазмі крові через 18-24 год після появи болю, досягаючи максимального значення через 48-72 год (у 90-95% пацієнтів з інфарктом міокарда рівень ЛДГ є у 2-10 раз більшим порівняно з верхньою межею допустимої величини).

Підвищена активність ЛДГ в плазмі утримується протягом 7-12 днів. Паралельно до зростання загальної активності ЛДГ зростає активність ЛДГ-1. Цей ізоензим є дуже важливим маркером інфаркту міокарда завдяки його властивостям, зокрема, тривалому часу присутності в плазмі крові. Чутливість ЛДГ у підтвердженні діагнозу інфаркту міокарда становить 90%, а діагностична специфічність – 90-99%. Чутливість можна підвищити шляхом визначення співвідношення активності ЛДГ-1/ЛДГ-2. Співвідношення, яке є більшим, ніж 1, виявляється у близько 75% хворих на інфаркт міокарда. Для цих хворих діагностична чутливість та специфічність є близькою до 100%, коли кров для дослідження брати між 24 і 96 год після появи болю.

При інфаркті міокарда загальна активність КК в плазмі швидко зростає, починаючи з 6-8 год від появи болю, і досягає максимального значення через 18-30 год. Підвищений рівень активності КК може утримуватися протягом 3-5 діб.

Рівень активності ізоензиму КК-МВ перед інфарктом міокарда переважно становить менше 6% від загальної активності КК. При інфаркті міокарда ця ізоензимна фракція зростає до 30%. При вмісті КК-МВ, що перевищує 20% від загальної КК, треба виключити інші причини підвищення активності КК-МВ.

Активність ізоензиму КК-МВ в плазмі починає зростати вже через 4-8 год після інфаркту міокарда, досягає максимального значення через 12-24 год, тобто швидше, ніж зростає загальна КК. Ця активність повертається до нормального рівня на 3-тю добу.

Діагностична чутливість для КК становить 93-98%, а для ізоензиму КК-МВ - близько 100%, тоді як діагностична специфічність становить відповідно 75-85% і 100% (для значення КК-МВ понад 6% від загальної активності КК).

Вважають, що найкращим ензиматичним тестом для підтвердження чи виключення діагнозу гострого інфаркту міокарда є КК-МВ, особливо за умов використання імунохімічних методів визначення цього ізоензиму.. Поруч з білками-ензимами у зв’язку з розвитком аналітичних імунохімічних методів неензиматичні білки, специфічні для міоцита, знаходять все більше практичне застосування у діагностиці інфаркту міокарда. Такими неензиматичними білковими маркерами для інфаркту міокарда можуть бути: міозин, тропонін-Т та -І, серцевий легкий ланцюг міозину (LС2).

Міоглобін, знаходиться в скелетних м'язах і в порівняно невеликих кількостях - у серцевому м'язі (близько 400 мг/100 г тканини) людини. Незважаючи на невелику кількість, кисень, зв'язаний з міоглобіном, може виконувати важливу роль, враховуючи дуже низький парціальний тиск (2,4 мм Нg), необхідний для досягнення 50% насичення міоглобіну. У нормальному серці кисень, зв'язаний з міоглобіном чи фізично розчинений у тканині, може підтримати роботу серця протягом 8 сек чи 8 скорочень при повній блокаді коронарного кровообігу. Енергія, необхідна для скоротливої активності серцевого м'язу, утворюється під час розщеплення АТФ. АТФ-аза, яка бере участь у м'язовому скороченні, локалізована у головці міозинового волокна.

Впровадження специфічного імунологічного методу для чутливого і швидкого визначення міоглобіну в сироватці крові дозволило використати цей тест у діагностиці інфаркту міокарда. Рівень міоглобіну в сироватці крові є дуже низьким (до 80 мкг/л) і залежить від статі та віку.

Рівень міоглобіну в сироватці зростає вже через 2-3 год після появи болю. Це на 3-4 год швидше, ніж зростання активності КК чи КК-МВ. Максимальна концентрація міоглобіну в сироватці виявляється між 6 і 8 год і перевищує у 10-25 разів нормальну величину. Цей максимум на 15-20 год випереджає появу максимальної активності КК чи КК-МВ. Повернення рівня міоглобіну до нормальної величини настає через 24-36 год після появи болю у грудній клітці.

Вже через 2 год підвищення рівня міоглобіну в плазмі крові спостерігається у 60% пацієнтів з інфарктом, а у 100% пацієнтів – через 3-5 год після появи болю.

Корекція біохімічних змін при лікуванні фармпрепаратами.

Для корекції біохімічних змін при інфаркті міокарда застосовують препарати, що направлені на ліквідацію тромболітичної оклюзії (стрептокіназа, урокіназа) і антикоагулянти (гепарин), ефект якого обумовлений активацією в плазмі інгібітора протеаз антитромбіна ІІІ. Інший напрям корекції направлений на зменшення потреб міокарда в кисні (нітрати, -адреноблокатори – анаприлін) і блокатори кальцієвих каналів (ізоптин, цинкарізин), важливе значення мають препарати, що розширюють коронарні судини – курантил, інгібуючи аденозиндезаміну сприяє утворенню вазодилятатора аденозина.



Біохімічні фактори розвитку атеросклерозу, патохімічні зміни при гіпертензії і їх фармакологічна корекція.

Атеросклероз – хвороба, головним проявом якої є відкладення в судинних стінках ліпідних утворень - ,,бляшок”.

Для розвитку атеросклеротичного процесу необхідні, крім порушень концентрації ліпідів крові, хоч незначні пошкодження ендотелію судин, які виникають внаслідок підвищеного тиску крові, запальних процесів, стресів, порушень згортання крові, дії токсичних агентів (нікотину, ендотоксинів тощо). Ліпопротеїни низької густини проникають в інтиму, поглинаються гладком’язовими клітинами та клітинами крові і накопичуються під ендотелієм судин. Крім того, ЛНГ можуть утворювати комплекси з кислими глікозаміногліканами і глікопротеїнами, яким притаманні автоімунні властивості.

Навкруги ліпідних бляшок в інтимі судин виникає клітинна реакція, що включає в себе утворення фіброзної тканини та проліферацію гладенько-м’язевих клітин. Атеросклеротичні бляшки спричиняють звуження кровоносних судин, посилене згортання крові в ділянках їх локалізації та, як результат, порушення кровопостачання відповідних органів і тканин. Як наслідок атеросклерозу розвиваються ішемічна хвороба серця, інфаркт міокарда, порушення церебрального кровообігу, що стають важливою причиною смерті. Припускається можливість утворення автоантитіл і розвиток патологічного процесу за типом автоімунного. Фагоцитовані ліпопротеїни піддаються розщепленню під дією ферментів лізосом. Білки, фосфоліпіди, триацилгліцерини утилізуються, а молекули холестерину, які не розщеплюються далі,утворюють ефіри з масляною кислотою і накопичуються у великих кількостях. Внаслідок значних структурних і функціональних змін мембран клітини гинуть. Атерогенні бляшки із продуктів лізису клітин і холестерину покриваються капсулою із сполучної тканини, йде інтенсивна проліферація фібробластів. Стінки судин деформуються, стають жорсткими, на поверхні бляшок розвивається тромб, просвіт судин звужується аж до закупорення.

Біохімічною основою розвитку атеросклерозу є підвищена концентрація в крові людини холестерину-гіперхолестеринемія, спричинена різними факторами- дієта, багата висококалорійними продуктами, надлишкова маса тіла, ендокренні, генетичні зміни. Сприяють проникненню холестерину в клітини кровоносних судин атерогенні ліпопротеїни ЛПНГ. Клінічне значення має вміст у плазмі загального холестерину, холестерину ЛПНЩ, його апо-В. Значно менше значення має рівень тригліцеридів і холестерину ЛПВЩ.

Потужним фактором захисту організму від розвитку атеросклерозу є підвищений рівень у плазмі крові ЛВГ, які усувають надлишок холестерину з клітин. Показано,що поліненасичені жирні кислоти обмежують всмоктування в кишечнику харчового холестерину, стимулюють у печінці синтез жовчних кислот, загальмовують синтез і секрецію ЛДНГ, проявляючи таким чином антиатерогенний ефект.

Для лікування атеросклерозу використовують дієтотерапію (обмеження холестерину, жирів з насиченими жирними кислотами, калорійності раціону, підвищене споживання поліненасичених жирних кислот, рослинної клітковини, пектинів). Антиатеросклеротичні препарати, шо застосовуються з метою профілактики та лікування атеросклерозу, спрямовані на зниження рівня гіперхолестеринемії шляхом впливу на різні боки метаболізму стеролу:

а) шляхом пригнічення всмоктування холестерину в кишечнику;

б) шляхом гальмування реакцій біосинтезу холестерину;

в) шляхом застосування інгібіторів -ГОМК-редуктази (мевакор, ліпобай);

г) шляхом стимулювання його екскреції з організму (квестран, гуарем);

д) шляхом активації метаболізму оксигеназами мішаної функції з утворенням гідроксильованих похідних (фенобарбітал, зиксорин).

Артеріальна гіпертезія – це патофізіологічне і клінічне поняття, яке об’єднує стан пацієнта, при якому спостерігається тривале підвищення гідростатичного тиску в артеріях великого кола кровообігу. В основі розвитку есенціальної артеріальної гіпертензії лежить ослаблення видільної функції нирок, що веде до затримки Na+ і води, а значить і збільшенню об’єму циркулюючої плазми і хвилинного об’єму серця. Підвищення АТ необхідне для забезпечення адекватного натрійуреза і діуреза, тобто має компенсаторний характер. Нормалізація об’єму внутріклітинної рідини і АТ в результаті ,,діуреза тиску” веде до ще більшої затримки нирками Na+ і води, що по механізму позитивного зворотнього зв’язку, усугубляє початкове збільшення циркулюючого об’єму плазми. У відповідь на підвищення хвилинного об’єму серця місцеві механізми саморегуляції викликають міогенне звуження артеріол, в результаті за рахунок підвищення загального переферичного опору судин нормалізується хвилинний об’єм серця.

Важлива роль у виникненні гіпертензії має порушення транспортування Na+ через клітинну мембрану, внаслідок зниження активності Nа++-ATФ-ази сарколеми, всередині клітини підвищується вміст Nа+. За обмінним механізмом Nа+-Са2+ підвищується концентрація внутріклітинного Са2+; підвищується тонус гладкої мускулатури артеріол і венул. Порушення функції Nа++ помпи можливо генетично детерміноване і правдоподібно пов’язане з циркуляцією у крові інгібітора, який поки що не виявлений.

Підвищення секреції передсерцевого натрійдіуретичного фактора при порушенні виділення нирками Nа+ є важливим механізмом, який направлений на нормалізацію об’єму позаклітинної рідини. Інгібуючи Nа+-K+-ATФ-азу цей пептид сприяє підвищенню вмісту внутріклітинного Nа+, а значить і Са2+ , що підвищує тонус і реактивність судинної стінки.

Важливе місце у патогенезі гіпертензії належить і ренін-ангіотензинальдостероновій системі, що підтверджується вираженним гіпотензивним ефектом інгібіторів АПФ (ангіотензин перетворюючий фермент).

Підвищений судинний тонус веде до гіпертрофії медії артеріоли, а значить змінюється відношення товщини стінки артеріоли до її внутрішнього радіусу, що приводить до значно більшого судинного опору, ніж в нормі. При аналізі сечі у хворих із злоякісною гепертензією виявляється значна протеїнурія і гематурія. В крові спостерігається гіперліпопротеїнемія.

Виходячи з патогенезу у лікуванні застосовують тіазідинові діуретики гіпотензивний ефект яких зв’язаний із зменшенням циркулюючого об’єму плазми внаслідок блокади помпи Nа+-K+-ATФ-ази в кортикальному сегменті висхідного відділу петлі Генле, -едреноблокатори (аденолол, надолол) знижують хвилинний об’єм серця,інгібітори АПФ (капотен, лизиноприл) викликають як і блокатори Са2+ каналів (верапамил) переферичну вазодилятонію.



ПРАКТИЧНА РОБОТА

Дослід 1. Визначення активності аспартатамінотрансферази.

Аспартат-аланінамінотрансферазам властива велика каталітична активність і вони широко розповсюджені в різних органах і тканинах: печінка, м’язи серця, нирки, скелетна мускулатура. Аспартат-амінотрансфераза каталізує реакцію:


глутамінова + щавелево-оцтова  аспарагінова + -кетоглутарова

кислота кислота  кислота кислота

Аланін-амінотрансфераза каталізує реакцію:
глутамінова + піровиноградна  -аланін + -кетоглутарова

кислота кислота  кислота


Принцип методу. Метод базується на утворенні забарвленого динітрофенілгідразона піровиноградної кислоти, яка звільняється в результаті реакції переамінування. Інтенсивність забарвлення пропорційна активності фермента.

Піровиноградна кислота + динітрофенілгідразон піровиноградної кислоти.

Гідразон піровиноградної кислоти у лужному середовищі дає забарвлення, інтенсивність якого пропорційна кількості утвореної піровиноградної кислоти.

Матеріальне забезпечення: 0,1 м фосфатний буфер, рН = 7,4 , 0,04% розчин бром-тимоловий синій, субстратний розчин для визначення аспартат-амінотрансферази: 29,2 мг -кетоглутарової кислоти і 2,66 г ДL аспарагінової кислоти зважують на аналітичних терезах і розчиняють в 1н розчині NаОН до повного розчинення осаду. Розчин переливають у мірну колбу на 100 мл і доводять фосфатним буфером об’єм до мітки.

Стандартний розчин піровинограднокислого натрію. 11мл кристалічного пірувату натрію розчиняють у невеликій кількості дистильованої води і доводять об’єм до 100 мл. 1мл розчину містить 110 мкг пірувату натрію, що відповідає 88 мкг піровиноградної кислоти. Розчин використовують для побудови калібрувального графіку.



Хід роботи: В пробірку вносять 0,5 мл субстратного розчину і прогрівають при 370 на протязі 5 хвилин. Потім додають 0,1 мл дослідної сироватки хворого і пробірку поміщають в термостат при 370 на 60 хвилин. Потім додають 0,5 мл динітрофенілгідрозинового розчину і витримують 20 хвилин при кімнатній температурі для розвитку реакції. Далі додають 5 мл 0,4 н NаОН, ретельно перемішують і залишають на 10 хвилин при кімнатній температурі для розвитку забарвлення. Оптичну густину вимірюють на фотоелектроколориметрі із зеленим світлофільтром (530 нм) в кюветі з робочою шириною 10 мм проти контрольної проби на реактиви. Контрольна проба на реактиви містить всі інгредієнти за вийнятком сироватки крові. Замість неї беруть 0,1 мл дистильованої води. Контрольну пробу інкубують у тих умовах, що і дослідну.

Розрахунок амінотрансферазної активності проводять по калібрувальному графіку. Найдену по ньому велику кількість піровиноградної кислоти множать на 10, отримують число од. фермента в 1 мл сироватки (1 од. відповідає такій активності ферменту, яка здатна у даних умовах досліду утворювати 1 мкг піровиноградної кислоти).



Побудова калібрувального графіку. В пробірку вносять інгредієнти вказані в таблиці, перемішують їх та додають по 0,5 мл 2,4-динітрофенілгідразину і через 20 хвилин вносять по 5 мл 0,4 н розчину NаОН.


№ пробірки

Стандартний розчин

Дистильована вода

Кількість мкмоль піровиноградної кислоти на 1 мл сироватки за 1 годину інкубації




мл

Вміст піровиноградної кислоти







мкг

Мкм

Аст

1.

0,05

4,4

0,05

0,55

0,5

2.

0,10

8,8

0,10

0,50

1,0

3.

0,15

13,2

0,15

0,45

1,5

4.

0,20

17,7

0,20

0,40

2,0

5.

0,25

22,0

0,25

0,35

2,5

6.

0,30

26,4

0,30

0,30

3,0

Проби колориметрують із зеленим світлофільтром в кюветах з робочою шириною 10 мм проти контрольної проби, в яку замість розчину піровиноградної кислоти є відповідна кількість дистильованої води.


Найдену по калібрувальному графіку кількість в мкг піровиноградної кислоти множать на 10 і отримують число одиниць фермента в одному мл сироватки (одна одиниця відповідає такій активності фермента, яка здатна в умовах досліду утворювати один мкг піровиноградної кислоти). У сироватці крові здорових людей вміст АсТ при застосуванні даного методу становить 8-40 одиниць.


Перерахунок активності ферменту в мкм піровиноградної кислоти, що утворюється при інкубації одного мл сироватки на протязі 1 години, при 370 С, проводять по формулі:

(а 10)/88

де а – кількість мкг піровиноградної кислоти,

88 – вага 1 мкм піровиноградної кислоти, мкг

10 – коефіцієнт перерахунку на 1 мл сироватки за 1 годину інкубації при 370 С.

Активність аспартатамінотрансферази даним методом проводиться на перший та п’ятий день захворювання.


Дослід 2. Уніфікований метод визначення активності лактатдегідрогенази (ЛДГ) за реакцією з 2,4-динітрофенілгідразину.

Принцип методу. Лактат під дією ферменту сироватки крові за наявності НАД окиснюється до пірувату, який визначають за кольоровою реакцією з 2,4-динітрофенілгідразином.

- 2Н


Н3С – СНОН – СООН  Н3С – СО – СООН

Матеріальне забезпечення: 1) молочна кислота (80% розчин), Na гідроксид (2 м, 0,4 м розчини), натрію лактат (0,45 м розчин). У мірну колбу ємкістю 100 мл вливають 5 мл 80% розчину молочної кислоти, додають 2 м розчин їдкого натру для досягнення рН 7,5 і доводять об’єм до позначки. Зберігають у посуді з темного скла в холодильнику; 2) хлоридна кислота (1 м розчин), натрію пірофосфат (0,03 м розчин з рН 8,8). 6,69 г натрію пірофосфату розчиняють у невеликій кількості води, додають 1 м розчин хлоридної кислоти для досягнення рН 8,8 і доводять об’єм водою до 500 мл. Стабільний протягом місяця у разі зберігання у холодильнику; 3) НАД, окислена форма. Готують з розрахунком 3 мг НАД на 1 мл води. Розчин стабільний протягом 4 тижнів у разі зберігання в холодильнику; 4) розчин 2,4-динітрофенілгідразину: 19,8 мг 2,4-динітрофенілгідразину розчиняють у невеликій кількості 1 м розчину хлоридної кислоти під час нагрівання на водяній бані; після охолодження доводять об’єм 1 м розчином хлоридної кислоти до 100 мл; наступного дня реактив фільтрують. Розчин зберігають у посуді з темного скла. Стабільний протягом 1 року; 5) натрію піруват (для побудови калібрувальної кривої): 11 мг кристалічного натрію пірувату розчиняють у невеликій кількості бідистильованої води, переносять у мірну колбу ємкістю 100 мл і доводять об’єм розчину до позначки; 1 мл розчину містить 88 мкг піровиноградної кислоти. Робочий розчин готують шляхом розбавлення основного розчину в 10 разів бідистильованою водою; 1 мл робочого розчину містить 8,8 мкг піровиноградної кислоти.

Хід роботи. 1. Дослідна проба. 0,1 мл сироватки крові, розведеної у співвідношенні 1 : 2 змішують з 0,3 мл розчину НАД, нагрівають протягом 5 хвилин за температури 370 С. Потім додають 0,8 мл 0,03 м розчину натрію пірофосфату і 0,2 мл 0,45 м розчину натрію лактат, попередньо нагрітих за температури 370 С, інкубують суміш за температури 370 С протягом 15 хвилин. Після інкубації додають 0,5 розчину 2,4-динітрофенілгідразину, витримують 20 хвилин за кімнатної температури. Потім доливають 5 мл 0,4 м розчину їдкого натру і через 10 хвилин вимірюють екстинкцію з товщиною шару 10 мм за довжини хвилі 500 – 560 нм при зеленому світлофільтрі порівняно з контрольною пробою. 2. Контрольну пробу ставлять так само, як дослідну, але сироватку додають після інкубації. Розрахунок активності здійснюють за калібрувальним графіком. Побудова калібрувального графіка: з робочого стандартного розчину натрію пірувату готують ряд розведень, як зазначено в табл. 17.

№ пробірки

Робочий стандартний розчин натрію пірувату, мл

0,03 М розчин натрію пірофосфату, мл

Бідистильована вода, мл

Вміст піровиноградної кислоти в стандартній пробі

Активність ЛДГ, нмоль/(с  л)

мкг

мкмоль

1

0,1

0,8

0,5

0,88

0,01

0,334

2

0,2

0,8

0,4

1.76

0,02

0,668

3

0,4

0,8

0,2

3,52

0,04

1,336

4

0,6

0,8

-

5,28

0,06

2,004

5

0,8

0,6

-

7,04

0,08

2.672

Потім у пробірки доливають по 0,5 мл розчину 2,4-динітрофенілгідразину. Далі стандартні проби обробляють і вимірюють, як дослідні. Контрольну пробу ставлять так само, як стандартну, але замість стандартного розчину додають воду.

Лінійна залежність між концентрацією піровиноградної кислоти й оптичною густиною зберігається за значень від 0 до 3000 нмоль / (с  л).

Нормальні значення: 220 – 1100 нмоль / (с  л), або 0,8 – 4 мкмоль / (год  мл) за температури 370 С.

Активність ЛДГ можна визначати в сироватці крові за допомогою тестового набору реактивів напівавтоматичним біохімічним аналізатором “Stat Fax 1904 plus”.

Значення для клініки та фармації


Отримані дані при дрібновогнищевому пораженні міокарда свідчать, що активність АсТ зростає і у середньому становить 62 од., при крупновогнищевому пораженні ці цифри вищі і складають 136 од. При повторному визначенні активності АсТ на 5-6 день захворювання ферментна активність нормалізується. Ці факти можуть мати прогностичне значення і підтверджують ьпокращення стану хворого.

При інфаркті міокарда зростає загальна активність ЛДГ, яка через 8-10 днів при сприятливому протіканні хвороби нормалізується.


Контроль виконання лабораторної роботи

  1. Як розподіляються трансамінази в органах і тканинах?

  2. На чому грунтується принцип методу визначення аспартатамінотрансферази і лактатдегідрогенази?

  3. Яку реакцію каталізує аскартат амінотрансфераза?

  4. Про що свідчать отримані Вами показники ферментної активності?

Приклади тестів

1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   12


База даних захищена авторським правом ©shag.com.ua 2016
звернутися до адміністрації

    Головна сторінка