Експериментальне моделювання кістково-суглобового туберкульозу



Скачати 142.81 Kb.
Дата конвертації14.04.2016
Розмір142.81 Kb.


УДК 616-092.9:616.71.72-002.5-07

(1)Харківський національний медичний університет

(2)ДУ «ІПХС ім.проф. М.І.Ситенка НАМНУ»

(3)КЗОЗ «Обласна туберкульозна лікарня №1»

Г.Г.Голка(1), Т.Г.Голка(2), І.М.Кузнецова(3), Т.А.Синенко(3)



Експериментальне моделювання кістково-суглобового туберкульозу

Основні відомості про патогенез туберкульозу як хронічної специфічної інфекції з часів Роберта Коха і до наших днів були отримані шляхом експериментальних дослідженнь, і їх успіху сприяло те, що туберкульоз відноситься до антропозооносних інфекцій. [1,5]

Перші досліди по моделюванню кістково-суглобового туберкульозу (КСТ) були проведені проф. Чистовичем А.Н. з співробітниками Ленінградського інституту хірургії туберкульозу (ЛІХТ) в 1935 році [5].

Заслуги і досягнення ЛІХТу в розвитку експериментального туберкульозу важко переоцінити. Всесвітньо відомі до цього часу роботи П.Г.Корнєва, Е.М.Белендіра присвячені вивченню патогенезу КСТ на експериментальних моделях даного захворювання у тварин. Але після об’єднання ЛІХТ та НДІ фтізіопульмонології в середині 90 років ХХ сторіччя заклад став називатися Санкт-Петербурзьський НДІ фтізіопульмонології, і основну увагу став приділяти вивченню експериментальних моделей легеневого туберкульозу. За останні 20 років з даного закладу вийшли поодинокі публікації присвячені експериментальному кістково-суглобовому туберкульозу. [1,2,3]

Експериментальні дослідження по моделюванню КСТ проводили також в Харківському НДІ травматології та ортопедії ім. М.І.Ситенко В.В.Струковим, та А.П.Скобліним [2,3].

Важливо підкреслити що дані дослідження проводились задовго до чіткої уяви про патогенез КСТ та в доантибактеріальну еру медицини, а переважна більшість всіх відомих моделей експериментального туберкульозу базується на внутрішньовенному гематогенному або внутрішньосуглобовому введенні мікобактерій туберкульозу, що не дозволяє, на нашу думку, повноцінно відтворити преартритичну стадію розвитку захворювання.

З метою вивчення сучасних особливостей клінічного та патоморфологічного перебігу КСТ нами була створена модель туберкульозу колінного суглоба на основі введення культури мікобактерії туберкульозу (МБТ) у проксимальний метаепіфіз великогомілкової кістки (позасуглобово).

Матеріал експериментального дослідження.

Дослідження проводились на експериментальній базі Інституту експериментальної та клінічної ветеринарної медицини УААН. Експерименти були проведені на 30 статевозрілих (більше 6 міс.) морських свинках (середня вага 350-500 грамів). Протокол експерименту на тваринах затверджений Комісією з Біоетики Харківської медичної академії післядипломної освіти (протокол №4 від 14 квітня 2011 року), відповідно з правилами “Європейської конвенції захисту хребетних тварин, що використовуються у експериментальних і інших наукових цілях”.

Моделювання туберкульозного артриту колінного суглобу проводилось на основі розробленого нами способу (Патент 70401 (UА) Спосіб моделювання кістково-суглобового туберкульозу у тварин.) [4].

При порівняльному вивченні будови колінних суглобів за даними літератури форма і величина суглобових поверхонь, розміри кісток, складових колінного суглобу морської свинки, відрізняються від людських, але загальний план анатомічної будови схожий (рис 1). Остання обставина дозволяє стверджувати, що колінний суглоб морської свинки може бути використаний для отримання експериментальної моделі туберкульозного гоніту.

Перед початком експерименту всі тварини були обстежені на предмет наявності у них паразитарних та інфекційних хвороб, з наступним проведенням реакції Манту з 25 туберкуліновими одиницями (ТО) m.bovis и m.avium. У всіх відібраних тварин результати туберкулінізації свідчили про відсутність імунітету до туберкульозу, це означає що дані тварини туберкульозом не хворіють і не хворіли.

Рисунок 1 – Нормальна рентгенанатомія колінного суглоба морської свинки.


Вибір місця зараження був обумовлений високою частотою (90%) локалізації первинного остита в області метафізів великогомілкової та стегнової кістки при туберкульозному артриті колінного суглобу у пацієнтів.

Експериментальне моделювання КСТ проводилось шляхом введення зависі m.bovis штам valle (0,1мг сухої маси в 1мл) внутрішньокістково згідно методики.

Виведення з експерименту тварин здійснювали шляхом передозування ефіру через 1 та 2,5 місяці. На першому етапі з експерименту після виявлення ознак преартритичної стадії туберкульозного артриту (через 1 місяць) було виведено з експерименту 10 тварин. На другому етапі після виявлення клініко-рентгенологічно артритичної стадії (через 2,5 місяці) також 10 тварин.

В подальшому ми чекали постартритичної стадії туберкульозного артриту або ремісії захворювання, але тварини загинули в терміни від 3,5 до 4 місяців. Причиною смерті цих тварин, за результатами макроскопічного обстеження при аутопсії, стала генералiзацiя інфекційного процесу з наступним ураженням життєво важливих органів та систем.



Методи експериментального дослідження

Методика зараження.

Знерухомлення тварин забезпечувалося внутрішньом’язовим введенням розчину ксилазину (5мг на 1 кг ваги). Морська свинка фіксувалася на верстаті на спині при максимально витягнутих лапах.

Шкіра в області правого колінного суглобу звільнялася від шерсті і оброблялася розчином йоду. Операційне поле відокремлювалось стерильними серветками. Проводився розтин шкіри довжиною близько 2,0 см по передньо-внутрішній поверхні колінного суглобу на рівні проксимального метаепіфізу великогомілкової кістки. Після розтину шкіри оголювався кортикальний шар великогомілкової кістки. За допомогою порожнистої мікрофрези проводили формування каналу в губчастій речовині проксимального метаепіфізу великогомілкової кістки орієнтовно на 0,5 см нижче суглобової щілини діаметром 2мм в напрямку спереду назад, зсередини назовні, знизу догори. Таким чином формувався канал діаметром 2-2,5 мм і глибиною близько 5 мм. позасуглобово.

Після зупинки кровотечі з спонгіозної тканини, за допомогою турунди змоченої в 3% розчині перекису водню, в канал вносилася культура МБТ 0,5мл зависі m.bovis штам valle (0,1мг сухої маси в 1мл). Канал пломбувався медичним воском з використанням кортикальної пластинки, отриманої під час трепанації, м'які тканини ушивались без місцевого застосування туберкулостатиків.



Клінічне дослідження.

За всіма тваринами проводилося динамічне спостереження з детальним клінічним оглядом, зважуванням, дослідженням функції суглоба. При клінічному обстеженні тварини враховували його поведінку, позу і характер пересування, оперований суглоб порівнювали з контрлатеральним. При оцінці нижніх кінцівок, звертали увагу на положення кінцівки, загальний вигляд її порівняно з протилежною стороною, контури суглобу і т.д. Пальпація області суглобу розширювала і доповнювала отримані дані шляхом оцінки стану шкіри, м'яких тканин, що оточують суглоб (зв'язки, капсула), епіметафізів кісток і вмісту порожнини суглоба. Визначалася амплітуда рухів в ураженому суглобі.

Через 1 місяць після зараження у всіх тварин групи спостереження зазначалося підвищення загальної температури в середньому на 0,5°, одночасно з'являлося і наростало обмеження рухів: згинання - на 10°, розгинання - на 5°. Втрата маси тіла тварин становила від 20,0 до 40,0 грам. Колінні суглоби збільшувалися в обсязі за рахунок інфільтрації і потовщення м'яких тканин. Рухи були обмежені, здійснювалися в межах: згинання – розгинання 0/140/65°. У десяти морських свинок сформувалися напливні абсцеси на передній та задній поверхні колінного суглобу. Поява абсцесів могло бути наслідком руйнування кортикального шару біля вогнища. На рентгенограмах визначався пороз кісток, що утворюють суглоб, в метафізі великогомілкової кістки навколо пломби було видно вогнище деструкції з руйнуванням кортикального шару. (рис 2)

Рисунок 2 – Вогнища деструкції у проксимальному відділі великогомілкової кісток.


Подальше спостереження за експериментальними тваринами показало, що в подальшому формувався і збільшувався в розмірі (тільки в межах метафіза) туберкульозний остит. Зміни в суглобі носили реактивний характер.

Протягом перших 6-10 тижнів продовжували зростати симптоми інтоксикації (млявість тварин, зниження апетиту), втрата у вазі становила в середньому 40 грам. Колінні суглоби були значно збільшені в обсязі за рахунок потовщення і інфільтрації м'яких тканин. Відзначалася різка згинальна контрактура, спроба оцінки рухів в суглобі викликала больову реакцію у тварини. Визначалася виражена кульгавість, так як із-за больового синдрому кінцівку тварини не навантажували. Абсцеси поширювалися на область стегна і гомілки, формувалися нориці. На рентгенограмах відзначалося збільшення деструктивних вогнищ, вони займали весь метафіз з переходом на суглобову поверхню великогомілкової кістки. Осередки деструкції містили різної форми і розміру секвестри (рис. 3).



Рисунок 3 – Вогнища деструкції у дистальному відділі стегнової та проксимальному відділі великогомілкової кісток.


Рентгенологічне дослідження.

Рентгенологічне дослідження проводилося за показами від 3 до 5 разів у період спостережень за твариною. Рентгенографія оперованого (зараженого) суглоба проводилася при фіксації морської свинки на спеціальному верстаті і знерухомленні ксилазином (5 мг на 1кг маси тварини) Вивчалися структура кісток, їх взаємовідносини в суглобі, стан суглобової щілини, розміри суглобових дефектів.



Виведення експериментальних тварин з досліду проводилося за раніше розробленим графіком: 1міс, 2,5 міс. Перед евтаназією тварини ретельно оглядали, а після неї - отримані макропрепарати піддавалися рентгенографії та патоморфологічному дослідженню.

Анатомічне дослідження.

Анатомічна препаровка і макроскопічне вивчення препаратів колінного суглоба проводилися безпосередньо після виведення з експерименту тварин. Колінні суглоби розкривалися передньо-зовнішнім доступом, таким чином вся суглобова поверхня була легко доступна огляду. Макроскопічно вивчався стан покривного хряща, синовіальної оболонки, м’язово-зв’зувального апарату, виготовлялися макропрепарати кісток.



Гiстологiчне дослiдження.

Для гістологічного дослідження виділяли колінні суглоби морських свинок та прилеглі м’язи і фіксували у розчині з масовою часткою нейтрального формаліну 10%. Для вивчення запального процесу в колінних суглобах проводили декальцинацію кісток у розчині з масовою часткою азотної кислоти 4% при температурі від 18 до 22°С. Кістки після декальцинації та прилеглі до суглобу м’язи зневоднювали у спиртах зростаючої міцності (50°, 70° спирти та двічі у 96°) та у спирті з ефіром (розчин 1:1), заключали у целоїдин. Гістологічні зрізи виготовляли на санному мікротомі Reichert та забарвлювали гематоксиліном і еозином та за Ван-Гізон. Гістологічний аналіз проводили за допомогою світлового мікроскопу Axio Star Plus (Carl Zeiss) з використанням для фотографування цифрової фотокамери Canon Power Shot A610 та комп’ютерної програми AxioVision.

При гістологічному дослідженні через 1 місяць після моделювання запального процесу у всіх тварин чітко виявлялася признаки запалення (інфекційного процесу).

Для характеристики патологічних змін в уражених суглобах морських свинок в преартритичнiй стадiї ми вважаємо достатнім привести один протокол патогістологічного дослідження.

При вивченні зрізу на рівні залягання менісків визначається інфільтрат, розташований під артикулюючою поверхнею на місці невеликого руйнування субхондральної кістки безпосередньо під суглобовим хрящем.

Серед інфільтратів визначається невелике некротичне вогнище з наявністю в ньому елементів розпаду. Суглобової хрящ над цим вогнищем витончений, має нерівну суглобову поверхню.

Запальний інфільтрат визначається і в основі меніска. Він пронизує суглобову сумку і частину перехідною складки, розм’якшуючи її.

Серед цього інфільтрату зустрічаються некротичні фокуси з зернистим розпадом клітинних елементів грануляційної тканини. Поряд з інфільтратом спостерігається запальний набряк пухкої сполучної тканини. У субхондральній кістці на межі з описаним вище субхондральним туберкульозним вогнищем в кісткових балочках спостерігаються некротичні зміни.

Вивчення інфільтрату під великим збільшенням показало, що він складається в основному з макрофагів, лімфоцитів і гистіоцитів, місцями зустрічається невелика кількість лейкоцитів. Вказані елементи свідчать про наявність явищ некробіозу.

Звертає на себе увагу невелика кількість кровоносних судин в інфільтраті, а місцями і повна відсутність таких.

Патогістологічний діагноз - туберкульозний остит.

Через 2,5 міс при патогістологічному дослідженні отриманих зразків поряд з формуванням продуктивного запалення в області червоного кісткового мозку в міжтрабекулярних просторах губчастої кістки проксимального метафазу великогомілкової кістки, остеопоротичними порушеннями, деструкцією кісткових трабекул -- виявляються виражені запальні прояви в синовіальній мембрані у вигляді ексудативного синовіта.

В колінному суглобі має місце потовщення суглобової капсули із розширенням її контурів за рахунок дифузної або локальної інфільтрації лімфоцитами і макрофагами. Синовіальна мембрана при цьому гіпертрофована, спостерігається виражена лімфоїдна інфільтрація і набрякання синовіальних ворсинок. В капсулі утворюються численні горбики (туберкульозні гранульоми) характерної будови з некрозом клітин в центральних відділах, по краю горбиків розташовується лимфоїдно-макрофагальный вал.

У горбику висока щільність епітеліоїдних клітин, які мають характерну будову - невелике слабобазофільне ядро, оточене рясною цитоплазмою. Присутні плазматичні клітини.

У міжтрабекулярних просторах має місце деструкція кісткового мозку і формування вогнищ продуктивного запалення і епітеліоїдно-клітинних горбиків, які відрізняються один від одного. Деякі з них не містять усіх елементів горбика. Вони представлені епітелиоїдними клітинами зі світлими овальними ядрами. У крайових відділах горбиків виявляється висока щільність лімфоцитів, макрофагів і фібробластів. Плазматичні клітини поодинокі.

В артритичній фазі туберкульозні горбики в субхондральній кістці займають значні території, їх формування пов'язано зі злиттям дрібних гранульом. У центральних відділах туберкульозних гранульом розташовуються великі вогнища клітково-тканинного некрозу. У крайових відділах має місце висока щільність, характерних для туберкульозних гранульом епітеліоїдних клітин, виявляються поодинокі плазматичні клітини.

Синовіальна оболонка суглоба гиперплазована, представлена стрічковидними структурами потовщених синовіальних ворсинок, в товщі яких, а також в капсулі суглоба розташовуються туберкульозні гранульоми, в яких у великій кількості визначаються епітеліоїдні клітини, що мають невеликі ядра і слабо базофільну рясну цитоплазму.

Не представляючи протоколи патогістологічних досліджень уражених суглобів інших морських свинок, ми можемо сказати, що у всіх випадках був виявлений туберкульозний артрит, із залученням в процес синовіальної оболонки, менісків суглоба, перехідної складки і капсули.

При гістологічному дослідженні останньої морської свинки з основної групи в епіметафізі великогомілкової кістки визначалось велике гранулематозно-некротичне вогнище. Кісткові секвестри були оточені гранульоматозною тканиною, в частині епіфіза що збереглася - велика кількість некротизованих балок. Остеогенез не виражений. Синовіальна оболонка потовщена, в області її прикріплення до плато великогомілкової кістки покривний хрящ був резорбований, визначалися розростання специфічних грануляцій. Суглобовий хрящ практично повністю зруйнований.

Наводячи підсумки спостереження за морськими свинками, ми приходимо до висновку, що у всіх випадках (30 морських свинок) при даному методі зараження був отриманий туберкульозний остеоартрит, підтверджений клінічно, патогістологічно, при чому туберкульозне запалення суглоба (туберкульозний артрит) при внутрішньокістковому позасуглобовому зараженні розвивається раніше ніж настає ураження легенів, з чого випливає, що та кількість туберкульозних паличок яка необхідна для виникнення вогнища в легенях, не відразу попадає у кров з кісткового вогнища, а поступово.

Таким чином, в нашому експерименті вдалося простежити стадійність розвитку гоніту у морської свинки і співвіднести фази його еволюції зі стадіями розвитку туберкульозного артриту, викладеними в класифікації Е.М. Белендіра [2] у відповідності з поставленими задачами.

Виявлена ідентичність моделі туберкульозу колінного суглоба у морської свинки при метаепіфізарному способі зараження основних клінічних форм туберкульозного гоніту у людини: до 4 тижнів розвивався туберкульозний остит поблизу суглоба (1 стадія по класифікації Е.М. Белендіра), до 10 тижнів - спостерігалося прогресування оститу з початком артриту (2 стадія по цій класифікації) і з послідуючим розпалом туберкульозного артриту колінного суглоба.

Важливо підкреслити що дана експериментальна модель дає змогу не лише виявити сучасні особливості клініко-рентгенологічного та патоморфологічного перебігу захворювання, а і розробити експериментальну модель різних оперативних втручань з залежності від стадії розвитку захворювання і дає можливість вивчити діагностичну цінність різних лабораторних методів діагностики КСТ, в тому числі і ПЛР.

Список літератури:


  1. Белендир Э.Н. Экспериментальная патология и хирургия внелегочного туберкулеза и ее клиническое значение // Хирургия внелегочного туберкулеза. - Л., 1983. - С.13-27.

  2. Белендир Э.Н. Современное представление о патогенезе внелегочного туберкулеза // Актуальные вопросы диагностики и лечения туберкулеза: научные труды Всерос. науч.-практ.конф.- СПб., 2006.- С.225-226.

  3. Костно-суставной туберкулез / под. ред. Ю.Н. Левашева и А.Е. Гарбуза.- М.: Медицина и жизнь, 2003.- 294 с.

  4. Пат. 70401 (UА) Україна, МПК G09B 23/28. Спосіб моделювання кістково-суглобового туберкульозу у тварин.// Корж М.О., Дєдух Н.В., Голка Т.Г.; заявник і патентовласник ДУ «Інститут патології хребта та суглобів ім. проф. М.І.Ситенка АМНУ». – №u20111317: заявл.21.11.2011; опубл. 11.06.2012, Бюл. №11

  5. Чистович А.Н. Патологическая анатомия и патогенез туберкулеза. – Л., 1973.

РЕФЕРАТ

Г.Г.Голка, Т.Г.Голка, І.М.Кузнецова, Т.А.Синенко



Експериментальне моделювання кістково-суглобового туберкульозу

Мета даної публікації є висвітлення процесу моделювання кістково-суглобового туберкульозу і його особливостей у морських свинок для подальшого використання результатів експерименту у лікувальній та науковій практиці.

Експеримент проводився на 30 статевозрілих морських свинках. Моделювання туберкульозного артриту колінного суглобу проводилось на основі розробленого нами способу (Патент 70401 (UА)).

За всіма тваринами проводилося динамічне спостереження з клінічними, рентгенологічними, патоморфологічними і лабораторними дослідженнями. Виведення експериментальних тварин з досліду проводилося за раніше розробленим графіком -- при виявленні ознак досліджуваних стадій туберкульозного процесу.

В результаті виконаної роботи вдалося простежити стадійність розвитку туберкульозного гоніту у морської свинки та відстежити сучасні особливості клінічного, рентгенологічного та патоморфологічного перебігу. Виявлена ідентичність моделі основних клінічних форм туберкульозу колінного суглоба у морської свинки та у людини.

Дана експериментальна модель кістково-суглобового туберкульозу дає змогу розробити експериментальну модель різних оперативних втручань з залежності від стадії розвитку захворювання і дає можливість вивчити діагностичну цінність різних лабораторних методів діагностики кістково-суглобового туберкульозу, в тому числі і полімеразної ланцюгової реакції.

Ключові слова: експериментальне моделювання, кістково-суглобовий туберкульоз, діагностика.

Г.Г.Голка, Т.Г.Голка, И.Н.Кузнецова, Т.А.Синенко



Экспериментальное моделирование костно-суставного туберкулеза

Целью данной публикации является освещение процесса моделирования костно-суставного туберкулеза и его особенностей у морских свинок для дальнейшего использования результатов эксперимента в лечебной и научной практике.

Эксперимент проводился на 30 половозрелых морских свинках. Моделирование туберкулезного артрита коленного сустава проводилось на основе разработанного нами способа (Патент 70401 (UА)).

За всеми животными проводилось динамическое наблюдение с клиническими и рентгенологическими, патоморфологическими и лабораторными исследованиями. Выведение животных из эксперимента проводилось по ранее разработанному графику -- при выявлении признаков исследуемых стадий туберкулезного процесса.

В результате проделанной работы удалось проследить стадийность развития туберкулезного гонита у морской свинки и отследить современные особенности клинического, рентгенологического и патоморфологического течения. Обнаружена идентичность модели основных клинических форм туберкулеза коленного сустава у морской свинки и у человека.

Данная экспериментальная модель костно-суставного туберкулеза дает возможность разработать экспериментальную модель различных оперативных вмешательств в зависимости от стадии развития заболевания и дает возможность изучить диагностическую ценность различных лабораторных методов диагностики костно-суставного туберкулеза, в том числе и полимеразной цепной реакции.

Ключевые слова: экспериментальное моделирование, костно-суставной туберкулез, диагностика.

G.Golka, T.Golka, І.Kuznetsova, Т.Synenko



Experimental modeling tuberculosis of bones and joints.
The purpose of this publication is the lighting of the process of modeling tuberculosis of bones and joints and its peculiarities in Guinea pigs for the further use of the results of the experiment in the medical and scientific practice.

The experiment was conducted on 30 Guinea pigs. Modeling of tuberculous arthritis of the knee joint was carried out on the basis of developed by us method (Patent 70401 (UA)).

All the animals was under dynamic observation with the clinical and Xrays, pathomorphlogical and laboratory researches. The euthanasia of animals from experiment was made at the earlier developed by the schedule -- after identification the signs of the studied stages of a tuberculous process.

As a result of the work done managed to trace the stages of the development of the tuberculosis gonitis in the Guinea pig and keep track of the modern features of clinical, x-ray and pathomorphological currents. Discovered the identity of the model of the main clinical forms of tuberculosis of the knee joint in the Guinea pig and a human.

This experimental model tuberculosis of bones and joints gives an opportunity to develop an experimental model of various surgical interventions depending on the stage of the disease and gives the opportunity to study the diagnostic value of various laboratory methods of diagnostics of osteo-articular tuberculosis, including polymerase chain reaction.

Keywords: experimental model,tuberculosis of bones and joints, diagnosis.





База даних захищена авторським правом ©shag.com.ua 2016
звернутися до адміністрації

    Головна сторінка